泛素化的關(guān)鍵是泛素肽附著（或連接）到賴氨酸殘基上。該小組試圖找出哪些賴氨酸殘基可能是CD73蛋白被泛素化的賴氨酸。他們鑒定了以下賴氨酸作為泛素化位點(diǎn)：K133、K208、K262和K321。為了確定這些賴氨酸對(duì)TRIM21介導(dǎo)的CD73降解的重要性，作者將這些特定殘基突變?yōu)榫彼?，理論上?huì)阻斷泛素化，得到多個(gè)突變TNBC細(xì)胞系：MDA-MB468-CD73^4KR（這4個(gè)賴氨酸殘基均突變?yōu)榫彼幔琈DA-MB468-CD73^K133R/K208R（K133和K208的賴氨酸突變?yōu)榫彼幔?，MDA-MB468-CD73^K262R/K321R（賴氨酸K262和K321突變?yōu)榫彼幔?/p>

將MDA-MB468-CD73^WT或MDA-MB468-CD73^4KR分別用APCP（CD73抑制劑）或不加APCP處理24小時(shí)，使用腫瘤條件培養(yǎng)基培養(yǎng)。收集突變TNBC細(xì)胞培養(yǎng)上清液。供體PBMCs加入收集的上清液，使用anti-CD3刺激，培養(yǎng)WT/No APCP、4KR/No APCP、WT/APCP或4KR/APCP四組細(xì)胞。在孵育72小時(shí)后，作者評(píng)估了供體PBMC分選的CD8+T細(xì)胞的多功能性和細(xì)胞多功能指數(shù)PSI。

研究者發(fā)現(xiàn)，與WT細(xì)胞的T細(xì)胞相比，加入突變細(xì)胞系培養(yǎng)上清的T細(xì)胞多功能和多功能指數(shù)總體耗盡。并且有趣的是，與未經(jīng)APCP處理的T細(xì)胞相比，經(jīng)APCP處理的T細(xì)胞的多功能性和PSI似乎略有增加（圖2）。

圖2：IsoPlexis檢測CD73及其泛素化位點(diǎn)突變

對(duì)于免疫細(xì)胞功能的影響

這意味著靶向CD73，通過增強(qiáng)其降解或簡單抑制其功能可能是增強(qiáng)免疫功能的可行選擇。他們也進(jìn)行了進(jìn)一步檢測以明確起關(guān)鍵作用的泛素化位點(diǎn)，培養(yǎng)MDA-MB468-CD73^K133R/K208R和MDA-MB468-CD73^K262R/K321R（圖3），評(píng)估其培養(yǎng)上清對(duì)于CD8+T細(xì)胞多功能和PSI的影響，結(jié)果顯示，K262和K321突變組的細(xì)胞多功能性和PSI均顯著降低，表明K262和K321是TRIM21介導(dǎo)CD73泛素化降解的關(guān)鍵賴氨酸位點(diǎn)。

此外，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用IFN?處理MDA-MB468細(xì)胞時(shí)，TRIM21水平顯著升高，CD73水平顯著降低。這表明，像CD8+T細(xì)胞這樣的IFN?分泌細(xì)胞的存在創(chuàng)造了一個(gè)反饋回路，從而提高腫瘤細(xì)胞中的TRIM21水平，進(jìn)而耗盡CD73水平。最后，本文總結(jié)了小鼠和患者的體內(nèi)數(shù)據(jù)，探討了TRIM21水平如何與小鼠模型腫瘤負(fù)荷和患者更有利的免疫信號(hào)相關(guān)?？傊?，作者闡明了CD73如何促進(jìn)TNBC的免疫逃避的機(jī)制，同時(shí)也揭示了CD73可以通過TRIM21進(jìn)行調(diào)控的機(jī)制。最終，這些數(shù)據(jù)為靶向CD73以提高免疫療法和其他類型的治療方法的有效性提供了一個(gè)案例。

文章點(diǎn)評(píng)